大量の生物学的サンプルの調製

Nature Protocols volume 18、pages 1441–1461 (2023)この記事を引用

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メトリクスの詳細

健康な臓器の形態や病態生理学的変化を理解するには、さまざまなスケールでの画像化が不可欠です。 無傷の人間の臓器を含む大きなサンプルのマクロスケールおよびミクロスケールの三次元形態は、X 線マイクロトモグラフィー (実験室用またはシンクロトロン線源を使用) で可能です。 しかし、高解像度イメージング用の大きなサンプルの準備は、サンプルの収縮、不十分なコントラスト、サンプルの移動、マウントまたはスキャン中の気泡の形成などの制限により困難です。 ここでは、X 線マイクロトモグラフィー用の大きな軟組織サンプルの準備、安定化、脱水、およびマウントについて説明します。 欧州放射光施設で人間の臓器全体と階層的位相コントラスト断層撮影に適用されるプロトコルを詳しく説明しますが、完全な生物を含むさまざまな生物学的サンプルに適用できます。 このプロトコルは、X 線イメージングを使用する際のコントラストを強化し、サンプルの向きが異なる場合でもスキャン中のサンプルの動きを防ぎます。 取り付け中に閉​​じ込められた気泡や、スキャン中に形成された気泡（シンクロトロン X 線イメージングの場合）は、複数の脱気ステップによって軽減されます。 サンプル前処理は、磁気共鳴画像法、コンピューター断層撮影法、組織学的観察にも対応しています。 人間の脳全体や心臓などの大きな臓器の場合、サンプルの準備と取り付けには 24 ～ 36 日かかります。 準備時間は組織の組成、サイズ、脆弱性によって異なります。 このプロトコルを使用すると、局所ボクセル サイズ 1 μm で直径 150 mm の無傷の臓器のスキャンが可能になります。 このプロトコルでは、人間または動物の臓器の取り扱い、実験室での操作、X 線画像処理などの専門知識を備えたユーザーが必要です。

健康と病気の両方における人間の器官形態の定量化は、次元スケールをまたがるマルチモーダル空間イメージング モダリティによって取り組むことができる複雑なタスクです。 完全な組織形態学的特徴付けには、スケール間およびスケール間の相互作用の検出が必要です。 ただし、ほとんどのイメージング技術は解像度または視野によって制限されているため、巨視的観察と顕微鏡的観察およびデータの橋渡しが困難です。 従来の組織学 1、2、3 または電子顕微鏡法 4、5、6 のアプローチでは、連続切片を通じて組織の微細構造組織と組成を視覚化でき、データを適切に定量化できます。 しかし、これらのアプローチは通常、組織のサンプリングと切片化を必要とし、非常に労力と時間がかかります。 光学的透明化とライトシート顕微鏡検査を組み合わせると、高解像度で広い視野が得られます。 ただし、組織の除去には長い時間が必要であり、多くの場合費用がかかります。 さらに、ライトシート顕微鏡の結像深度は、対物レンズの作動距離によって制限されます7、8。 成人の人間の臓器全体 8 や動物の臓器全体 9 が数か月かけて採取された場合でも、それらを画像化することは依然として困難です。 同様の欠点は、光コヒーレンストモグラフィー 10,11、多光子顕微鏡法 12、または共焦点顕微鏡法 13,14 にも当てはまります。これらは、細胞スケールで組織の局所的な三次元 (3D) 微細構造を捕捉することができますが、組織浸透が限られており、深部組織のイメージングを妨げます 15。 最近、高解像度磁気共鳴画像法 (MRI) により、生体外の人間の脳全体で 100 μm の等方性ボクセル サイズが達成されました 16。 MRI は非破壊的で広い視野を持っていますが 17、分解能は組織の微細構造を検査するにはまだ十分ではありません。 階層イメージング技術は、解像度と視野の間のトレードオフを克服できます。 階層的アプローチでは、同じサンプルの複数の画像が異なる解像度で取得され、異なるスケールを橋渡しします。 マイクロコンピューター断層撮影法 (μCT) を使用して肺全体を 150 μm ボクセルの解像度で画像化し、続いて肺内の生検コアを抽出します。 次に、これらの小さなコアをμCTでスキャンして、10 μmのボクセルを実現しました18。